Οι 7 παράγοντες αναξιοπιστίας των μοριακών τεστ PCR για την ανίχνευση και ταυτοποίηση ιών

17-06-2021

Καταρχήν να πούμε ότι η μέθοδος, που σημειωτέον έχει βραβευτεί με Νόμπελ το 1989, χρησιμοποιήθηκε σχετικώς με επιτυχία για το γρήγορο πολλαπλασιασμό τμημάτων του DNA οργανισμών γεγονός που οδήγησε στην ευκολία δημιουργίας γενετικών βιβλιοθηκών με τις γενετικές αλληλουχίες των οργανισμών (τμήματα γενετικών μορίων) που κωδικοποιούσαν ιδιότητες κυτταρικές, σημαντικές για την γενετική μηχανική και την βιοχημική παραγωγή ουσιών μέσω γενετικής τεχνολογίας.

Ωστόσο εκείνο που έχει αποσιωπηθεί είναι η σχετική κι όχι απόλυτη επιτυχία της μεθόδου καθώς είναι πολύ συχνά τα λάθη της αναπαραγωγής των γενετικών τμημάτων …λάθη που προφανώς οφείλονται στις εξαιρετικά τεχνητές, αφύσικες συνθήκες στις οποίες υποβάλλονταν τα γενετικά μόρια που περιείχαν τις "αλληλουχίες στόχους".

Οι συνθήκες αυτές πχ οι υψηλές θερμοκρασίες, τα ειδικά διαλύματα ενεργοποίησης των ενζύμων που χρησιμοποιούνται είναι δυνατόν να δώσουν λάθος συνδέσεις των μεμονωμένων νουκλεοτιδίων μεταξύ τους από αυτά που προστίθενται στο αντιδραστήριο (θα μιλήσουμε παρακάτω για αυτό το αντιδραστήριο) αλλά και λάθος θέσεις αρχικής εκκίνησης άρα σύνδεσης των μορίων--αλληλουχιών γενετικών που βάζουμε στον αντιδραστήριο και ονομάζονται εκκινητές.

Η αναξιοπιστία αυτή έγινε ακόμη πιο κρίσιμη όταν η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση γενετικού υλικού ιών.

Έξι είναι οι βασικοί παράγοντες της αναξιοπιστίας αυτής των συγκεκριμένων μοριακών τεστ PCR (test Polymerase Chain Reaction-Aλυσσιδωτής Aντίδρασης Πολυμεράσης):

-οι υψηλές θερμοκρασίες,
-οι εκκινητές,
-η "σούπα" νουκλεοτιδίων,
-τα ειδικά ένζυμα,
-τα ειδικά διαλύματα,
-η δυναμοποίηση δηλαδή οι κύκλοι που θα πραγματοποιηθούν
-ο χρόνος διενέργειας των κύκλων των αντιδράσεων

Η συνεργία των παραπάνω 7 παραγόντων στην δημιουργία ψευδών αποτελεσμάτων συνοψίζεται ως εξής:
σε ειδικές θερμοκρασιακές συνθήκες, με ειδικές αλληλουχίες RNA του επίμαχου κορωναιού (εκκινητές) και με τη βοήθεια των ενζύμων πολυμεράσης και αντίστροφης μεταγραφάσης και μιας "σούπας" νουκλεοτιδίων μονωμένων. Απλά μετά από κατάλληλη "δυναμοποίηση" (πολλαπλές επαναλήψεις ενός κύκλου μιας ορισμένη σειράς γενετικών αντιδράσεων) δημιουργείται τεχνηέντως αυτό που θέλουμε να ανιχνεύσουμε. Η πιθανότητα να δώσει μια τέτοια διαδικασία εντελώς ψευδή αποτελέσματα ως προς την παρουσία του εν λόγω γενετικού προς ανίχνευση μορίου είναι μεγάλη εφόσον απλά το ίδιο το τεστ δημιουργεί σε μεγάλες ποσότητες τα εν λόγω προς ανίχνευση μόρια ακόμη κι αν στο δείγμα που ερευνάται δεν υπάρχει ίχνος του επίμαχου μορίου.

Αλλά ας δούμε αναλυτικά τι συμβαίνει.

Τι είναι το δείγμα;
Το δείγμα που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του ιού είναι ρινοφαρυγγικό ή στοματοφαρυγγικό επίχρισμα δηλαδή έκκριμα των αντίστοιχων βλεννογόνων, πάει να πει μέσα σε αυτό είναι δυνατόν να υπάρχουν πλήθος γενετικών μορίων ή τμημάτων αυτών από άλλους ιούς της κατηγορίας των DNA ή RNA, από αυτούς του γνωστού κρυολογήματος τύπου κορωναιού ή άλλων τύπων

Τι είναι το αντιδραστήριο;
Οι ουσίες που εμπεριέχονται στους δοκιμαστικούς σωλήνες του αντιδραστήριου για να ξεκινήσει σε ειδική συσκευή η διεργασία ανίχνευσης είναι:

- το δείγμα προς εξέταση και ότι αυτό περιέχει (πιθανά μια «σούπα» γενετικών μορίων)
- ειδικοί «εκκινητές» δηλαδή αλληλουχίες γενετικών μορίων που ομοιάζουν με εκείνες τμημάτων του προς ανίχνευση ιού
- ειδικά ένζυμα πχ πολυμεράση και αντίστροφη μεταγραφάση
- «σούπα» ελεύθερων νουκλεοτιδίων (που θα χρησιμοποιηθούν για να την δημιουργία γενετικών αντίγραφων των μορίων που είναι προς ανίχνευση)
-ειδικά διαλύματα ισχυροποίησης της δράσης των ενζύμων

Τι είναι ένας ο κύκλος των γενετικών αντιδράσεων και πως σε κάθε βήμα του κύκλου υπεισέρχεται η πιθανή αναξιοπιστία της μεθόδου;

Ένας κύκλος γενετικών αντιδράσεων περιλαμβάνει 4 βήματα που πραγματοποιούνται σε διαφορετικές θερμοκρασίες:

Στο 1ο Βήμα πραγματοποιούνται σε θερμοκρασίες πάνω από 90οC, τα γενετικά υπάρχοντα μόρια του δείγματος, λέμε ότι "τήκονται" και διαχωρίζονται οι αλυσσίδες, αν μιλάμε για DNA γενετικά μόρια. Αν μιλάμε όμως για RNA μόρια εκεί όσα συμβαίνουν μπορεί να είναι χαοτικά λόγω των αφύσικων τεχνητών συνθηκών.
Στο βήμα αυτό η αναξιοπιστία υπεισέρχεται λόγω υψηλών θερμοκρασιών και των γενετικών αντιδράσεων των χαοτικών που μπορούν να συμβούν σε τέτοιες θερμοκρασίες και με τέτοια αντιδραστήρια όπως διάσπαση των εκκινητών, διάσπαση των γενετικών μορίων του δείγματος, μμετατροπές RNA σε DNA, αν στο δείγμα έχουμε RNA μόρια, αδρανοποίηση των ενζύμων που περιμένουμε να δράσουν στα επόμενα βήματα, δημιουργία νέων γενετικών μορίων άσχετων με αυτά που θέλουμε να ανιχνεύσουμε από συγκόλληση τυχαία των ελεύθερων νουκλεοτιδίων με τους εκκινητές ή των εκκινητών μεταξύ τους.
Στο 2ο Βήμα που πραγματοποιείται σε πιο χαμηλές θερμοκρασίες 50 έως 60οC περιμένουμε οι εκκινητές που υπάρχουν να αρχίσουν να συνδέονται στα συμπληρωματικά σημεία των υπάρχοντων μέσα στο αντιδραστήριο γενετικών μορίων.
Στο βήμα αυτό η αναξιοπιστία είναι συνακόλουθη του χάους που έχει δημιουργηθεί στο πρώτο βήμα και επιπροσθέτως υπάρχει η πιθανότητα οι "εκκινητές" να συνδεθούν σε λάθος σημεία των υποτιθέμενων γενετικών μορίων προς ανίχνευση, που υπάρχουν στο αρχικό δείγμα, το οποίο μετά την είσοδό του στο αντιδραστήριο και την θέρμανση του έχει γίνει χαοτικό κι ανεξέλεγκτο.
Επίσης η αναξιοπιστία αυξάνεται αναλόγως με το μήκος των εκκινητών που χρησιμοποιούνται και την ποσότητα τους και βέβαια αναλόγως με το χρόνο που το αντιδραστήριο παραμένει στο στάδιο αυτό.
Εδώ το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται μπορεί να είναι απλά ένα αναξιόπιστο πρωτόκολλο που πραγματικά οδηγεί τη μέθοδο σε ορισμένα προτετελεσμένα αποτελέσματα που δεν έχουν καμμιά σχέση με αυτό που υποτίθεται επιδιώκουμε να κάνουμε μέσω των τεστ αυτών.
Στο 3ο Βήμα που πραγματοποιείται σε θερμοκρασίες γύρω στους 70οC αρχίζει υποτίθεται η αναμενόμενη επιμήκυνση των μορίων στόχων του δείγματος από τις θέσεις όπου έχουν συνδεθεί οι εκκινητές στα επίμαχα γενετικά μόρια μέσα στη χαοτική κατάσταση του αντιδραστηρίου, πάντα.
Εδώ περιμένουμε να δράσουν τα ένζυμα κι ένας πρόσθετος παράγοντας αναξιοπιστίας είναι πάντα ο χρόνος παραμονής στο στάδιο αυτό και η πιθανή αδρανοποίηση πολλών από τα ένζυμα, ή αό την άλλη η υπερδράση τους, η χαοτική κι ανεξέλεγκτη όπου συνδέουν πέρα όσα ορίζουν τα «καλούπια» της επιθυμητής γενετικής αλληλουχίας, διάφορα νουκλεοτίδια μεταξύ τους.
Βέβαια η αναξιοπιστία αυτή ενισχύεται αναλόγως της ποσότητας νουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκε στο αντιδραστήριο.
Κι εδώ πάλι το ίδιο το πρωτόκολλο μπορεί να δημιουργεί τις συνθήκες αναξιοπιστίας
Στο 4ο Βήμα με το οποίο και κλείνει ο κύκλος των αντιδράσεων επιδιώκεται με αύξηση της θερμοκρασίας πάλι γύρω στους 90οC, η εκ νέου διάσπαση των αλυσσίδων των γενετικών μορίων που δημιουργήθηκαν μέσα στο χαοτικό αντιδραστήριο.

Τι είναι η δυναμοποίηση;
Η επανάληψη της σειράς των αντιδράσεων που προαναφέραμε μπορεί να δώσει σε 20 κύκλους και σε χρόνο περίπου 2 ωρών (κάθε κύκλος κρατά περίπου 5-6 λεπτά) πάνω από 1.000.000 αντίγραφα, υποτίθεται του προς ανίχνευση γενετικού μορίου.
Κι εδώ μπορεί να χρησιμοποιηθούν πολύ περισσότεροι κύκλοι και αυτό είναι ζήτημα ανοχής του πρωτόκολλου και βέβαια μπορεί να υπάρξει αυθαιρεσία (εσκεμμένη ή απρόσκοπτη) των ειδικών υγειονομικών που διενεργούν τα τεστ μια αυθαιρεσία που υπεισέρχεται σε όλα τα στάδια –βήματα του κάθε κύκλου δίνοντας τη δυνατότητα και διαβλητών αποτελεσμάτων ή ανθρώπινου κι απρόσκοπτου λάθους

ΔΕΙΞΑΜΕ λοιπόν με αναλυτική αναφορά στους παράγοντες αναξιοπιστίας κατά την διενέργεια των διαφόρων βημάτων του κάθε κύκλου αντιδράσεων του εν λόγω τεστ, ότι τα ποσοτικά ανιχνεύσιμα αποτελέσματα και η θετική άρα απόκριση του τεστ στο διερευνόμενο ιό, ουσιαστικά αντιπροσωπεύουν ένα χάος παραγόμενων γενετικών μορίων και πολύ πιθανή μια ψευδεπίγραφη σήμανση κινδύνου μόλυνσης από τον επίμαχο προς ανίχνευση ιό.

ΠΗΓΕΣ

-Για τον πολλαπλασιασμό του DNA και τη μέθοδο PCR
Βιολογία Προσανατολισμού Γ΄ Λυκείου
http://ebooks.edu.gr/ebooks/v/html/8547/2726/Biologia-G-Lykeiou-ThSp_html-apli/
https://www.youtube.com/watch?v=-hSho6q2oB4
https://student.cc.uoc.gr/uploadFiles/184-%CE%A7%CE%97%CE%9C-165/7.%20Recombinant%20DNA%20techniques%20-PCR-lect.3.pdf