Αλφαβητάριο για τα διαγνωστικά μικροβιολογικά τεστ - Μέρος_B

Ποταμίτου Διονυσία21-04-2021

6)Τι είδους μικροβιολογικές διαγνωστικές μέθοδοι υπάρχουν γενικά;

Έχουμε τρείς βασικές κατηγορίες διαγνωστικών μεθόδων:

α) τη μικροβιακή καλλιέργεια όπου διενεργείται σε κατάλληλο μέσο (στερεό, υγρό) και με κατάλληλους βοηθητικούς χημικούς ή οργανικούς παράγοντες πολλαπλασιασμός του εξεταζόμενου μικροβίου που διευκολύνει την περαιτέρω μελέτη

β) τη μικροσκοπική ανάλυση με την βοήθεια ηλεκτρονικών μικροσκοπίων και πολλές φορές σε συνδυασμό με τις άλλες διαγνωστικές μεθόδους

γ) τις βιοχημικές μεθόδους που είναι σχετικά με τις προηγούμενες μεθόδους πολύ πιο γρήγορες και στηρίζονται σε γενετικές αντιδράσεις ή άλλες βιοχημικές αντιδράσεις των προϊόντων των μικροβίων ή των αντισωμάτων που δημιουργούνται ως άμυνα στους οργανισμούς, με ειδικά επιλεγμένα αντιδραστήρια (άλλες χημικές ενώσεις) δίνοντας ανιχνεύσιμα αποτελέσματα (πχ αλλαγή χρώματος αντιδραστηρίου)

7)Από τι εξαρτάται η επιλογή της διαγνωστικής μεθόδου;

Η διαγνωστική μέθοδος επιλέγεται ανάλογα:

-με το μολυσματικό παράγοντα που θέλουμε να ανιχνεύσουμε (πχ για την ανίχνευση μυκητών και βακτηρίων επιλέγονται η μικροβιακή καλλιέργεια και μικροσκοπική ανάλυση ενώ οι βιοχημικές μέθοδοι για την ανίχνευση ιών

- με το τι επιθυμούμε να κάνουμε, αν επιθυμούμε να ερευνήσουμε αναλυτικά το μικρόβιο και πώς αντιδρά με τα κύτταρα που επιμολύνει ή απλά να διαγνώσουμε μια λοίμωξη και να παρέχουμε θεραπεία δεδομένου ότι το μικρόβιο είναι ήδη επαρκώς διερευνημένο

-με την πίεση που δημιουργούν επείγουσες επιδημιολογικές καταστάσεις και την ανάγκη να ελεγχθούν γρήγορα δείγματα από πολλά άτομα

-το κόστος τους και διαθεσιμότητα των αντιδραστηρίων

-την αξιοπιστία (ευαισθησία και ειδικότητα τους)

-την ειδική εκπαίδευση που απαιτείται για την διενέργεια των διαγνωστικών δοκιμασιών

8)Ποιες βιοχημικές μεθόδους ανίχνευσης μολυσματικών παραγόντων έχουμε;

Έχουμε:

α) Τα τεστ αντισωμάτων που διενεργούνται με δείγμα αίματος που λαμβάνεται με αιματοληψία σε ειδικό κέντρο ή με μια απλή σταγόνα αίματος (για πιο γρήγορη-rapid διάγνωση) και ανιχνεύουν ειδικά αντισώματα τα λεγόμενα IgA, IgM και IgG.
Η μέθοδος στηρίζεται στις βιοχημικές αντιδράσεις συγκόλλησης των αντισωμάτων αυτών με τα αντιγόνα του ιού ή με άλλους βιοχημικούς παράγοντες και την παραγωγή ανιχνεύσιμων προϊόντων.
Η αξιοπιστία του κρίνεται από τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται αν είναι πράγματι αντιδραστήρια ανίχνευσης του συγκεκριμένου ιού και βέβαια από την δυνατότητα αντισώματα διαφόρων ιογενών λοιμώξεων ανεπαίσθητων πολλές φορές να προκαλούν τις συγκεκριμένε αντιδράσεις και να δίνουν λαθεμένα θετικά αποτελέσματα .ως προς την διάγνωση του συγκεκριμένου ιού.
Η διάγνωση μπορεί να απαιτεί κάποιες ώρες ή να είναι πολύ πιο γρήγορη
(περίπου 30 λεπτά)
Το τεστ προϋποθέτει ότι η λοίμωξη να είναι σε τελικό στάδιο ώστε να υπάρχει η απαραίτητη ποσότητα αντισωμάτων ως αντίδραση του ανοσοποιητικού, γι' αυτό και δεν συνίσταται για πρωτογενή διάγνωση.
Χρησιμοποιείται ως συμπληρωματικό του μοριακού τεστ σε ασθενείς που έχουν ήδη νοσήσει και δίνουν μια τελική λοιμωξιολογικη εκτίμηση της κατασταση του.
Είναι κατάλληλο για ευρείες επιδημιολογικές έρευνες γενικού ιικού φορτίου.

β) Tα τεστ αντιγόνου (τα κατεξοχήν rapid) διενεργούνται με λήψη επιχρίσματος –έκκρισης ρινοφαρυγγικού ή στοματοφαρυγγικού (από το βλεννογόνο της μύτης η του φάρυγγα) με ειδικό στειλεό που μετά την λήψη τοποθετείται σε ειδικό σωληνάριο-αντιδραστήριο.
Η μέθοδος στηρίζεται στην άμεση ανίχνευση πρωτεϊνών της επιφάνειας ή του εσωτερικού του αντιγόνου άρα του ίδιου του ιού με την βοήθεια βιοχημικών αντιδράσεων συγκόλλησης με ουσίες που περιέχονται μέσα στο αντιδραστήριο στο οποίο τοποθετείται το δείγμα
Τα τεστ για να έχουν αξιοπιστία πρέπει να ληφθούν μέσα σε ορισμένα χρονικά πλαίσια, τουλάχιστον λίγες ήμερες (3-4) μετά την μόλυνση και το πολύ σε μια βδομάδα από την έναρξη των συμπτωμάτων ώστε να έχει καταρχήν παραχθεί η απαιτούμενη ποσότητα αντιγόνων ώστε να καθίσταται δυνατή η ράπιντ ανίχνευση τους και για να μη έχει αρχίσει η εξουδετέρωση τους από τα αντισώματα του οργανισμού.
Ο χρόνος που απαιτείται για τη διάγνωση είναι εξαιρετικά μικρός (15 ως 30 λεπτά)
Έχουν λοιπόν τα τεστ αντιγόνου κατώτερο κι ανώτερο όριο ημερών για την πραγματοποίηση τους προκειμένου να είναι αξιόπιστα, αλλά και πάλι η αξιοπιστία τους θεωρείται είναι πολύ χαμηλότερη από εκείνη των μοριακών τεστ.

γ) Τα μοριακά τεστ τύπου PCR (Polymerase Chain Rraction – Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης) αποτελούν την κορωνίδα της μικροβιολογικής ιικής ανίχνευσης με την μεγαλύτερη υποτίθεται αξιοπιστία, τα αποτελέσματα βγαίνουν συνήθως σε λίγες ώρες (4ώρες) και στηρίζονται στην ανίχνευση του γονιδιώματος του μολυσματικού ιού που επιτυγχάνεται με μια μέθοδο που χρησιμοποιείται σχεδόν 40 χρόνια για τον πολλαπλασιασμό τμημάτων γενετικών μορίων.
Η μέθοδος όπως χρησιμοποιείται από τους γενετιστές έχει επιτρέψει την δημιουργία εκατομμυρίων αντιγράφων διαφόρων τμημάτων των γενετικών μορίων σε μικρό σχετικά διάστημα (ξεπερνώντας στις δυσκολίες που είχε ο χρονοβόρος πολλαπλασιασμός μέσω κλωνοποίησης γενετικά τροποποιημένων κυττάρων)
Η μέθοδος έχει βραβευτεί με Νόμπελ Χημείας τη δεκαετία του '80 και σε αυτήν στηρίζεται η σύγχρονη γενετική μηχανική για τη δημιουργία γενετικών βιβλιοθηκών που κωδικοποιούν διάφορες βιοχημικές κυτταρικές ιδιότητες των οργανισμών.

Η εφαρμογή της μεθόδου στην μικροβιολογία υποτίθεται <<έλυσε >> τα χέρια των μικροβιολόγων που είχαν σοβαρό πρόβλημα έγκαιρης ανίχνευσης μολυσματικών μικροβίων εξαιτίας της χαμηλής ποσότητας τους στα δείγματα που ελάμβαναν.

Ο χρόνος που απαιτείται για την διάγνωση μέσω μοριακού τεστ, κυμαίνεται από 2 έως 4 ώρες (σχετικά γρήγορα τεστ) ή και παραπάνω (τα αργά μοριακά PCR τεστ).
Η μέθοδος πραγματοποιείται σε ορισμένο αριθμό κύκλων που είναι δυνατόν να παράξουν εκατομμύρια αντίγραφα του γενετικού τμήματος του ιού που στοχοποιείται κι είναι προς ανίχνευση .
Κάθε κύκλος διενεργείται σε 4 βήματα όπου υψηλές θερμοκρασίες εναλλάσσονται με χαμηλότερες σε ειδικές συσκευές.
Στις ειδικές συσκευές τοποθετείται στους δοκιμαστικούς σωλήνες το δείγμα που είναι το επίχρισμα-έκκριμα ρινικό ή φαρυγγικό που έχει ληφθεί, μαζί με άλλους σημαντικούς για την αλυσιδωτή αντίδραση, βιοχημικούς παράγοντες όπως:

- μίγμα μεμονωμένων νουκλεοτιδίων που είναι τα «γράμματα» του γενετικού κώδικα

- κατάλληλα τμήματα του γενετικού υλικού του ιού έτοιμα, που τα λέμε εκκινητές που είναι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που αντιγράφουν τις αλληλουχίες κάποιων του γονιδιώματος του ιού

- ποσότητες από ειδικά ένζυμα (πολυμεράση, αντίστροφη μεταγραφάση) για την σύνδεση των νουκλεοτιδίων

- ποσότητες από ειδικά ένζυμα (πολυμεράση, αντίστροφη μεταγραφάση) για την σύνδεση των νουκλεοτιδίων

-ειδικά διαλύματα που ενισχύουν τη δράση των ενζύμων

9) Γιατί θεωρούμε υπερβολική την προβολή της μοριακής μεθόδου PCR ως εγγυημένης αξιόπιστης μεθόδου;

H θεώρηση μας αυτή έχει σχέση με τις παρακάτω ενστάσεις και υποψίες μας:

α) είναι δυνατόν μέσα στα ειδικά αυτά αντιδραστήρια υπό υψηλές θερμοκρασίες να υπάρχει παράξενη υποτροπή των γενετικών αντιδράσεων, σε σημείο μάλιστα οι ίδιες οι τεχνητές συνθήκες να δημιουργούν αυτό που θέλουμε να ανιχνεύσουμε παράγοντας εκατομμύρια αντίγραφα των αρχικών «εκκινητών» είτε συνδεδεμένων μεταξύ τους είτε συνδεδεμένων σε λάθος σημεία με κάποια αρχικά γενετικά μόρια του δείγματος αλλά και με άλλα νουκλεοτίδια από την «σούπα» των νουκλεοτιδίων, χωρίς να υπάρχει το προς ανίχνευση ιικό γενετικό υλικό στο αρχικό δείγμα.

β) η δυναμοποίηση της μεθόδου, δηλαδή το πόσοι κύκλοι από την συγκεκριμένη αντίδραση θα χρησιμοποιηθούν από τους διενεργούντες το τεστ, για να ποσοτικοποιηθούν τα αποτελέσματα της ύπαρξης του επίμαχου ιού, είναι ένα σοβαρό θέμα που καθιστά τη μέθοδο άκρως διαβλητή …κάποια τεστ μπορεί να γίνονται σε πολύ λίγους κύκλους και να κρίνονται αρνητικά, ενώ άλλα μπορεί να φτάνουν και τους 50 κύκλους ώστε να εμφανιστεί με τεχνητό τρόπο επαρκής ποσότητα του προς ανίχνευση γενετικού υλικού του ιού (υπάρχουν για αυτά ιατρικά πρωτόκολλα αλλά ποιος γνωρίζει αν τα πρωτοκολλα αυτά είναι αντικειμενικά κι έντιμα ως προς την στόχευση τους και αν τελικά τηρούνται στην πράξη από τους μικροβιολόγους)

10) Τι συμβαίνει με την «κούρσα» των εμπορικώς διακινούμενων βιοχημικών rapid tests, την Εποχή της Πανδημίας του COVID-19;

Όλα τα εμπορικώς διακινούμενα τεστ τους τελευταίους μήνες και σε συνθήκες απίστευτων περιοριστικών μέτρων, «τρέχουν» με ρυθμούς καταιγιστικούς και με τρελό ανταγωνισμό ανάμεσα στις εταιρείες και στοχεύουν βασικά στην εμπέδωση μιας γρήγορης-rapid ανιχνευτικής δυνατότητας, εύκολης μαζικής χρήσης, κάτι που έρχεται σε αντίθεση με τις αναγκαίες απαιτήσεις σε χρόνο μιας ολοκληρωμένης και αξιόπιστης διαγνωσικής διεργασίας.
Ισχύει πάντα ο κανόνας της διαγνωστικής μικροβιολογίας "ό,τι κερδίζουμε σε χρόνο διάγνωσης το χάνουμε σε αξιοπιστία".

Υπάρχει πάντα το ενδεχόμενο, λοιπόν, μέγιστης απάτης εκ μέρους των εταιρειών που έχουν εμπλακεί σε αυτή την πυρετώδη κούρσα, προφανώς λόγω των ειδικών συνθηκών βιοτρομοκράτησης και ευκαιρίας πολύ υψηλής κερδοφορίας αν όχι αισχροκέρδειας.
Λόγω των ειδικών συνθηκών και σε αντίθεση με άλλα φαρμακευτικά προϊόντα η διακίνηση αυτών των ανιχνευτικών τεστ ελάχιστα έως καθόλου δεν ελέγχεται από τους δημόσιους υγειονομικούς φορείς.
Οι δημόσιοι φορείς κρατούν γενικά σιγή ως προς την αξιοπιστία των τεστ, η πιστοποίηση τους δεν διενεργείται παράλληλα κι από εθνικούς φορείς αλλά αποσπάται ως επίσημος εμπορικός τίτλος μόνο από διεθνείς φορείς, δεν υπάρχει δηλαδή εθνικός φορέας που να εγκρίνει τα φαρμακευτικά αυτά προϊόντα, πάει να πει έχουμε μια άνευ προηγουμένου στροφή και κάμψη στον έλεγχο της αγοράς αυτής, κατοχυρωμένης μάλιστα δια νόμων ψηφισμένων εντός της πανδημίας.

ΠΗΓΕΣ

-Για τον ανασυνδυασμό DNA και τη μέθοδο PCR

- Βιολογία Προσανατολισμού Γ΄ Λυκείου
ebooks.edu.gr

-Γενική Μικροβιολογία και Διαγνωστική
books.google.gr

-Για τα βιοχημικά τεστ
www.metropolitan-hospital.gr

-Για την μέθοδο πολλαπλασιασμού γενετικού υλικού PCR
student.cc.uoc.gr